An der Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften in Wädenswil wurde eine Sammlung backwarenrelevanter Schimmelpilze aufgebaut, mittels der antifungale Sauerteigkulturen getestet werden können.
Brot und andere Bäckereiprodukte bieten durch ihren aw-Wert zwischen 0.93 und 0.96 und einen pH-Wert zwischen 5 und 6 ein optimales Substrat für das Wachstum von Schimmelpilzen. Der Verderb durch Schimmelpilze stellt eine der Hauptursachen für eine Verminderung der Haltbarkeit dieser Produktkategorie dar (Santos et al., 2017).
Die Kontamination von Brot und Bäckereiprodukten passiert in der Regel nach dem Backen im Ofen, da die im Mehl vorhandenen Schimmelpilzsporen durch die hohen Temperaturen während des Backprozesses abgetötet werden. Der Befall kann während des Transports, des Auskühlens, der Lagerung, des Schneidens und des Verpackens der Produkte erfolgen. Die wichtigsten Überträger der Keime sind Luft, Geräte, Verpackungen, Maschinen und Arbeiter (Müller, 1997; Schünemann et al., 2016).
Biocontrol zur Unterdrückung von Schimmelpilzen
Um die Haltbarkeit von Brot und Backwaren zu verlängern, werden häufig Konservierungsmittel eingesetzt. Sowohl in der Schweiz als auch in der EU sind bis zu 3000 mg/kg Propionate und bis zu 2000 mg/kg Sorbate bei abgepackten, geschnittenen Broten und Roggenbrot zugelassen. Der Einsatz von Essigsäure und deren Salzen (Acetate) sowie von Milchsäure und deren Salzen (Lactate) ist gemäss guter Herstellungspraxis (quantum satis) in Broten, hergestellt aus Weizenmehl, Wasser und Hefe oder Sauerteig und Salz, erlaubt (Regulation (EC) No 1333/2008; ZuV, 2013).
Die Verwendung chemischer Konservierungsmittel zur Verlängerung der Haltbarkeit gerät allerdings immer mehr in die Kritik, einhergehend mit dem Wunsch der Konsumenten nach naturnahen Lebensmitteln. Eine mögliche Alternative, dem Schimmelwachstum entgegenzuwirken, ist die Biocontrol, welche in den letzten Jahren zunehmend an Interesse gewonnen hat. Bei der Biocontrol werden Mikroorganismen oder deren Stoffwechselprodukte gezielt eingesetzt, um Verderbs- oder Krankheitserreger zu unterdrücken. Im Bereich der Backwaren eignen sich dazu Sauerteige, die mit antifungalen Kulturen, v.a. Milchsäurebakterien, fermentiert und anschliessend den Backwaren zugesetzt werden (Megan et al., 2012; Axel et al., 2017).
International wurde eine Verzögerung des Schimmelwachstums auf Backwaren durch die Zugabe von antifungalen Sauerteigen schon von mehreren Forschungsgruppen beschrieben (Gerez et al., 2009; Ryan et al., 2011; Garofalo et al., 2012; Le Lay et al., 2016; Luz et al., 2019). Nebst dem, dass dieser Ansatz nachhaltig und kostengünstig ist, entspricht er dem Prinzip des Clean Labelings. Darüber hinaus bringen Sauerteige durch verbesserte sensorische und ernährungsphysiologische Eigenschaften der Backwaren einen allgemeinen Mehrwert für den Konsumenten (Rollán et al., 2010; Zannini et al., 2012).
Welche Schimmelpilze sollten jedoch für die Entwicklung solcher antifungalen Sauerteige herangezogen werden? Die Antwort ist einfach: Schimmelpilze, welche produktrelevant sind und in der Praxis gehemmt werden sollten.
Im Rahmen einer Studie der Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW) wurde die Schimmelbelastung in der Luft von Schweizer Bäckereibetrieben als mögliche Kontaminationsquelle für Brot untersucht. Zudem wurden Schimmelisolate aus der Luft und aus Brot von industriellen Bäckereien isoliert und identifiziert, wobei der Aufbau einer Sammlung backwarenrelevanter Schimmelpilze im Vordergrund stand, um künftig Strategien für gezielte Unterdrückungen zu entwickeln, wie z.B. eine Biocontrol mit antifungalen Sauerteigen.
Abbildung 1: Brotrelevante Schimmelpilze
Luft- und Brotuntersuchungen
Um ermitteln zu können, inwiefern die Schimmelpilze aus der Umgebungsluft auf die Produkte gelangen bzw. verbleiben, wurde in einem ersten Schritt die Luft bei fünf industriellen Schweizer Bäckereibetrieben an drei verschiedenen Probenahmeorten (A, Teigaufbereitung; B, vor bzw. im Gärschrank; C, nach dem Ofen bzw. vor dem Abpacken) mittels aktiven und passiven Verfahrens bezüglich Schimmelbelastung untersucht. Die aktive Luftuntersuchung erfolgte an den oben erwähnten Standorten mittels Luftkeimsammler MAS-100 NT (MBV, Stäfa), wobei 100 und 500 Liter Luft aktiv gesaugt wurden. Für die passive Luftuntersuchung wurden Petrischalen mit geeigneten Nährmedien auf einer geraden Fläche an den gleichen Standorten platziert und für 60 Minuten offen gelassen. Nach 5 Tagen Inkubation der Petrischalen bei 25°C wurden die Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) ausgezählt und die Schimmelpilze dokumentiert.
Parallel zu den Luftuntersuchungen wurden zwischen 5 und 20 zeitgleich hergestellte und abgepackte Brote aus den entsprechenden Betrieben als zufällige Proben gezogen und zwischen 4 und 7 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Bei den untersuchten Broten wurden mit einer Ausnahme keine Konservierungsstoffe eingesetzt. Alle Brote wurden aus Weizenmehl hergestellt, wobei teilweise ein geringer Anteil Roggenmehl und bei einem Brot ebenfalls Maismehl eingesetzt worden ist. Der aw-Wert der untersuchten Brote variierte zwischen 0.89 und 0.94 und der pH-Wert zwischen 5.52 und 5.67.
Anschliessend wurden alle Schimmelpilze, die in zwei Bäckereien aus der Luft des Probenahmeortes C (100 l) isoliert wurden, und eine Auswahl an Schimmelpilzen, die sich während der Lagerung auf den Broten von drei Bäckereien entwickelten, auf Malt Extract Agar [20 g/l Malt Extract Broth (Biolife, 4016602), 15 g/l Agar Bacteriological (Biolife, 4110302)] isoliert bzw. transferiert. Reine Schimmelpilzisolate wurden in die Stammsammlung der Forschungsgruppe Lebensmittelbiotechnologie integriert und mittels Gen-
Sequenzierung der ITS Region und des Gens β-Tubulin identifiziert. Weitere Details zum Vorgehen finden Sie auf der Website von brot+backwaren unter www.brotundbackwaren.de/zusatzinfos.html.
Schimmelbelastung in der Luft von industriellen Bäckereibetrieben
Die Daten der aktiven Luftuntersuchungen (Abbildung 2) zeigen, dass die Schimmelpilzbelastung bei allen überprüften Bäckereibetrieben beim Probenahmeort A (Teigaufbereitung) geringer war und weniger stark schwankte als beim Probenahmeort B (vor/im Gärschrank) oder beim Probenahmeort C (nach dem Backprozess/vor dem Abpacken). Die Luftuntersuchung beim Probenahmeort A war nur in drei der fünf Bäckereien möglich. Die Schimmelbelastung schwankte zwischen 70 und 170 BKE/m3 resp. 10 und 470 BKE/m3, abhängig davon ob Dichloran 18% Glycerol (DG18) Agar (Oxoid, CM0729) resp. Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol (DRBC) (ISO) Agar (Oxoid, CM1148) eingesetzt worden war. Die Luftuntersuchung bei Probenahmeort B konnte in vier von fünf Bäckereien durchgeführt werden, wobei der Median der Schimmelbelastung in der Luft zwischen 230 bzw. 245 BKE/m3 variierte, wenn DG18 bzw. DRBC verwendet wurde. Die einzelnen Werte schwankten zwischen 30 und 1240 KBE/m3 auf DG18 und 0 und 1010 KBE/m3 auf DRBC. Beim Probenahmeort C lag die Schimmelbelastung in der Luft je nach Bäckerei zwischen 10 und 1390 KBE/m3, wobei abhängig vom Nährmedium der Median zwischen 270 und 243 KBE/m3 lag. Bei einer der Bäckereien war die Schimmelbelastung am Probenahmeort C nicht auswertbar. Die in Abbildung 2 höchsten dargestellten Werte für den Probenahmeort B (1240 KBE/m3) und Probenahmerort C (1390 KBE/m3) wurden abgeschätzt, da die Platten ein sehr starkes Wachstum aufwiesen und das Auszählen dadurch beeinträchtigt wurde.
Abbildung 2: Boxplot der Schimmelpilzbelastung in der Luft von Bäckereibetrieben an drei Probenahmeorten: A (Teigaufbereitung), B (vor bzw. im Gärschrank) und C (nach dem Ofen bzw. vor dem Abpacken) ermittelt mittels aktiver (100 l) Luftuntersuchung auf DG18 und DRBC. Die schwarze Linie in der Box entspricht dem Median
Es gibt bis heute nur wenige Studien, welche die Schimmelbelastung in Bäckereien oder anderen lebensmittelproduzierenden Betrieben aufzeigen. Im Vergleich zu den in der vorliegenden Studie erhobenen Daten zeigte eine Untersuchung in deutschen Bäckereien, dass die Luft in Brotlagerräumen einen durchschnittlichen Keimgehalt von 85 bis 5000 Sporen/m3 aufweisen kann. In einigen Produktionszonen konnten sogar bis zu 90‘000 KBE/m3 gemessen werden (Legan, 1993). Da sowohl in der Schweiz als auch in der EU keine Richtlinien für die Schimmelbelastung in der Luft von Lebensmittelbetrieben vorhanden sind, können diese Zahlen nicht wertend interpretiert werden. Die Keimbelastung in der Luft hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie beispielsweise Wetterlage, Lüftung, Anzahl Personen im Raum, Aktivitäten, die im Raum stattfinden, und kann innerhalb eines einzigen Tages stark variieren (Legan, 1993).
Bei den passiven Untersuchungen (Abbildung 3) variierten bei allen überprüften Bäckereibetrieben die im Durchschnitt sedimentierten Schimmelpilzsporen/h zwischen 1 und 3 KBE/h für die Probenahmeorte A und B. Der Probenahmeort C (nach dem Backprozess/vor dem Abpacken) wies, wie auch schon bei den aktiven Untersuchungen beobachtet, höhere Werte auf. Der Median der Belastung lag zwischen 11 und 12 KBE/h, abhängig davon, ob DG18 oder DRBC eingesetzt worden war. Dies würde bedeuten, dass Brot im Verpackungsbereich mit einer Rate zwischen ca. 0.17 und 0.19 Sporen/cm2/h kontaminiert wird. Vergleichsweise ermittelte Spicher (1980) in seinen Untersuchungen Kontaminationsraten zwischen 1 und 4 Sporen/cm2/h für Brot in deutschen Bäckereien.
Abbildung 3: Schimmelpilzbelastung in der Luft von Bäckereibetrieben an drei Probenahmeorten: A (Teigaufbereitung), B (vor bzw. im Gärschrank) und C (nach dem Ofen bzw. vor dem Abpacken) ermittelt mittels passiver Luftuntersuchung während 1 h auf DG18 und DRBC. Die fette Linie in der Box entspricht dem Median
Sammlung backwarenrelevanter Schimmelpilze
Gesamthaft wurden 299 Schimmel aus den aktiven und passiven Luftuntersuchungen am Probenahmeort C und 113 Schimmel aus Brot isoliert. Die isolierten Schimmelpilze wurden nach makroskopischer Beurteilung auf geeigneten Nährmedien in 51 Gruppen eingeteilt. 127 der 412 Schimmel konnten keiner Gruppe zugeordnet werden. Insgesamt 195 Schimmelpilzisolate, bestehend aus Vertretern der einzelnen Gruppen und aus Schimmelpilzen, welche keiner Gruppe zugeordnet werden konnten, wurden mittels Gen-
Sequenzierung der ITS Region und des Gens β-tubulin identifiziert. Von den 412 isolierten Schimmelpilzen konnten 12 Brotisolate und 95 Luftisolate nicht identifiziert werden.
Bei den Schimmelpilzen aus der Luft (Abbildung 4 A) gehörten 33.1% der Gattung Penicillium, 18.7% der Gattung Aspergillus, 10.7% der Gattung Cladosporium und 5.7% diversen anderen Gattungen, wie Alternaria spp. (1.3%), Mucor spp. (0.7%), Rhizopus microsporus (0.3%), Lichtheimia spp. (0.3%), Paecilomyces variotii (0.3%) und Trichoderma spp. (1.3%), an. 31.8% der Isolate konnten nicht identifiziert werden. Unter den identifizierten Schimmelpilzen waren 48.5% Penicillien, 27.5% Aspergillen, 15.7% Cladosporien und 8.3% weitere Gattungen.
Abbildug 4: Identifizierte Isolate aus der Luft (A) und Brot (B) von Schweizer Bäckereibetrieben. Die Identifizierung erfolgte mittels Gen-Sequenzierung (IST Region und β-Tubulin Gen)
Vergleichbar mit dieser Studie konnte die Prävalenz der Gattungen Penicillium, Aspergillus und Cladosporium in der Luft von Bäckereibetrieben auch in Untersuchungen von anderen Forschungsgruppen und in verschiedenen Ländern beobachtet werden (Garcia et al., 2019; Cornea et al., 2011; Singh & Singh, 1994). Diese Erkenntnisse erhärten die Relevanz dieser Gattungen in der Backwarenbranche.
Die Schimmelpilze isoliert aus Brot (Abbildung 4 B) gehörten zu 48.7% der Gattung Penicillium, zu 25.7% der Gattung Cladosporium, zu 9.7% der Gattung Aspergillus und zu 1.8% anderen Gattungen an. 3.5% der Isolate wurden als Saccharomycopsis fibuligera (eine Hefe) identifiziert und 10.6% der Isolate konnten nicht identifiziert werden.
In einer Untersuchung in Grossbritannien wurde das Auftreten von Schimmelpilzen auf Broten aus 46 Bäckereien während eines Jahres ermittelt. Ähnlich wie in der vorliegenden Studie konnten Penicillium spp. und Aspergillus spp. häufig beobachtet werden, Penicillium spp. kam dabei auf fast jedem Brot und Aspergillus spp. sowie Cladosporium spp. jeweils bei der Hälfte der untersuchten Brote vor (Legan & Voysey, 1991).
Bei ca. 50% der in der vorliegenden Studie isolierten Penicillium sp. aus Brot handelt es sich wahrscheinlich um die Spezies P. crustosum, bei den Aspergillen der Sektion Flavi um die Spezies A. flavus und bei den Aspergillen der Sektion Nigri um A. niger, da diese Spezies beim Blasten (Vergleichen der erhaltenen Gen-Sequenzen mit Sequenzen aus einer Datenbank) die häufigsten Treffer waren. P. crustosum kommt sehr häufig in Innenräumen vor und wurde in Belgien beispielsweise in Schokoladefabriken isoliert (De Clercq et al., 2015). A. flavus und A. niger wurden in einer dänischen Studie ebenfalls in einer industriellen Bäckerei aus Brot isoliert und machten in 4 Jahren 3.3 % (156:4687) resp. 2.8 % (129:4687) der isolierten Schimmelpilze aus (Lund et al., 1996). P. crustosum, A. flavus und ebenfalls A. niger sind gemäß Literatur typische Brotverderber (Reiss, 1973). P. crustosum ist unter anderem in der Lage, Roquefortin C, eine neurotoxische Substanz, zu bilden (Kokkonen et al., 2005). Darüber hinaus sind viele Stämme der Spezies A. flavus in der Lage, das Mykotoxin Aflatoxin zu bilden (Varga et al., 2011), und A. niger kann ein Ochratoxin-A-Bildner sein (Frisvad et al., 2011).
Quellen und Versuchsablauf
Die zitierten Quellen sowie eine Beschreibung des Ablaufs der Luftuntersuchungen und der Identifizierung der isolierten Schimmelpilze sind online ersichtlich unter www.brotundbackwaren.de/zusatzinfos.html.
Schlussfolgerung
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen exemplarisch das aktuelle Bild der Schimmelpilzbelastung in der Luft von fünf Schweizer Grossbäckereien sowie einen Überblick zu der dominierenden Schimmelpilzflora sowohl in der Luft als auch auf Brot. Da die Prävalenz von Penicillien, Aspergillen (vor allem der Sektion Flavi) und Cladosporien sowohl in der Luft als auch auf Brot beobachtet werden konnte, ist davon auszugehen, dass die Schimmelbelastung in der Luft von Bäckereibetrieben eine mögliche Kontaminationsquelle für Brot darstellt. Die im Rahmen dieser Studie aufgebaute Sammlung an identifizierten Schimmelpilzen sind repräsentative Vertreter von Brotverderbern und eignen sich für den Einsatz in Screenings und Challenge Tests für die Entwicklung antifungaler Sauerteige in einer Biocontrol-Strategie.
Autoren
Susette Freimüller Leischtfelda,
Susanne Miescher Schwenninger a
a Forschungsgruppe Lebensmittelbiotechnologie,
Institut für Lebensmittel- und Getränkeinnovation, Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften (ZHAW), Wädenswil, CH
